亞寵展、全球寵物產業風向標——亞洲寵物展覽會深度解析
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2025-04-01
熒光定量數據分析軟件（實時熒光定量分析）
本篇文章給大家談談熒光定量數據分析軟件，以及實時熒光定量分析對應的知識點，希望對各位有所幫助，不要忘了收藏本站喔。
今天給各位分享熒光定量數據分析軟件的知識，其中也會對實時熒光定量分析進行解釋，如果能碰巧解決你現在面臨的問題，別忘了關注本站，現在開始吧！
該儀器采用集成Twister?機械臂的TaqMan?微流體芯片，可以輕松進行數百次實時定量PCR反應。QuantStudio? 7 Flex系統可助您最大限度提高自動化輸出能力。
兼容各類應用
優化的實驗方案和試劑與直觀的軟件相結合，兼容最廣泛的應用。
獲得值得信賴的結果
OptiFlexTM系統擁有六組分離的激發與發射濾片和21片濾片組合，能夠確保最高的多重分析能力和化學反應靈活性，提高孔與孔之間、儀器與儀器之間的數據精確性。
1. 主要技術要求
1.1 *內置96孔模塊，可升級96孔快速模塊及384孔模塊；
1.2 *開放5通道檢測，連續波長檢測，另外可以升級至6色激發光通道和6色檢測光通道及21色熒光；
1.3 采用檢測光濾光片分光，熒光通道開放，用戶可自行添加熒光種類；
1.4 *冷CCD檢測器96孔/384同步成像；
1.5 *最高升降溫速率均可達到：6.5°C/秒；
1.6 *溫控范圍：4～99.9°C；
1.7 動力學線性范圍：檢測10個起始拷貝，101~109九個數量級，致信度99.7%。區分度要有裝機試劑盒驗證：能分辨1250、2500、5000、10000、20000拷貝數的初始模板標準品各4個重復驗證線性準確度，36個重復的5000拷貝和36個重復的10000拷貝能以99.7%的置信度加以區；
1.8 *有防系統誤差方法可供用戶選擇:內參比熒光Rox,校正加樣誤差和管間差異；
1.9 可分辨單位細胞起始拷貝數1~5拷貝之間的樣本99.7%置信度；
1.10 *可分辨起始拷貝數200與300的樣本（0.5倍差異）；可實現單拷貝起始模板的區分；
1.11 *高能量合金鹵素燈激發,單個光源壽命不低于2000小時；
1.12 可升級HRM（高分辨率熔解曲線）分析系統，用于高通量篩選分析單核酸多態性位點（SNP）, 高分辨熔解曲線分辨率： 低至 0.04°C；
1.13 支持35分鐘以內完成40循環的快速熒光定量PCR實驗；
1.14 軟件組成：
1.14.1 配備完備的定量PCR軟件,等位基因分析軟件。原廠的探針及引物設計軟件，可用于PCR引物，巢式PCR，多重PCR引物，RT-PCR引物和Taqman探針的設計和自動測試；
1.14.2 可配備相對定量基因表達軟件，可同時對無限個數據進行自動的分析、比對、作出柱狀圖，用于基因表達，藥物療效考核等相對定量分析；
1.14.3 配備完備的定量PCR軟件,等位基因（SNP）分析軟件和陰陽性結果自動判定軟件；
1.15 試劑耗材開放；
1.15.1 可提供原廠人類、大鼠、小鼠、果蠅和擬南芥等多種模式生物全基因組范圍表達試劑盒基因表達試劑盒（試劑盒包含:正/反向引物，TaqMan探針，）且同一PCR條件；
1.15.2 可提供原廠人類、大鼠、小鼠、果蠅和擬南芥等模式生物microRNA檢測試劑盒（試劑盒包含:正/反向引物，TaqMan探針，）且同一PCR條件；
1.15.3 支持耗材：國際標準96孔 (0.2 mL) 反應板與光學蓋膜，0.2 mL八連管，0.2mL單管；
1.16 內置觸摸屏電腦：觸摸屏電腦可備份還原超過100次的實驗數據,可快速地設置多種應用；
*1.17 原裝進口。
肌動蛋白基因（ACT）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPD H）、18S rRNA、轉錄延伸因子基因（EF-1α）、多聚泛素酶基因（UBQ）、α微管蛋白基因（TUA）和β微管蛋白基因（TUB）等看家基因在之前的研究中常常被當作內參基因進行使用[5-8]。然而，越來越多的研究表明，在某種試驗穩定表達的內參基因，在另一種試驗中有可能是變化的[9-11]，而在任何試驗條件下都能穩定表達的內參基因幾乎不存在[12-13]。如果僅僅根據文獻報道使用某個常用的內參基因，不僅可能導致試驗結果的不準確性，甚至可能導致結論的錯誤。因此，本著嚴謹的科學態度，科研工作者首先必須從眾多的內參基因中篩選出在各自試驗條件下較為穩定的內參基因。
geNorm、NormFinder和BestKeeper是專門用于篩選內參基因穩定性的軟件，但這3種軟件的使用方法和分析的側重點各不一樣，為了讓相關科研人員快速了解并掌握這3種軟件的使用方法，筆者結合自身使用這些軟件的經歷，詳細介紹了這3種軟件的使用要點，以期為相關科研人員分析內參基因穩定性提供便利。
1geNorm軟件
1.1軟件概述
geNorm軟件是Vandesompele等[14]在2002年編寫的專門用于實時熒光定量PCR中篩選內參基因及確定最適內參基因數目的程序，該程序可以用于篩選任何試驗的任意數目的內參基因，并最終挑選出2個或2個以上的內參基因組合來校正數據，可使相對定量的結果更為精確。geNorm 程序通過計算出每個內參基因穩定性的M值來篩選出穩定性較好的內參基因，判定標準為M值越小內參基因穩定性越好，反之，則穩定性越差。該軟件還可計算引入1個新的內參基因后標準化因子的配對變異V值，并根據V n/V n+1值來確定所需最適內參基因的數目。默認的V值為0.15（該值可以人為稍作調整），如果V n/V n+1值<0.15，則最適內參基因的數量是n個；而如果V n/V n+1值0.15，則最適內參基因的數量是n+1個。
1.2操作流程
1.2.1修改Excel表格安全性級別。若geNorm軟件打開后不能正常運行時，可能是由于Excel表格默認宏的安全性級別設置的比較高，這時需要將Excel表格安全性級別更改到最低級別。更改方法為點擊Excel表格中的“工具”按鈕，然后點擊其下拉菜單“宏”的子菜單“安全性”選項，在彈出來的“安全性”對話框中將安全級別設置為最低。
1.2.2計算△Ct值。先找到該基因在所有樣品中最小的Ct （Cycle threshold）值（表達量最高），再用其他樣品的Ct值減
利用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件進行內參基因穩定性
分析的方法
吳建陽1何冰1杜玉潔1李偉才2魏永贊2*
（1嶺南師范學院基礎教育學院，廣東湛江524037；2農業部熱帶果樹生物學重點實驗室，中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所）摘要實時熒光定量PCR（RT-qPCR）由于具備靈敏度高、重復性好、特異性強及高通量等優點，已經成為研究基因表達分析的常用方
法，但其結果的準確性取決于內參基因。在任何試驗條件下都能穩定表達的內參基因幾乎不存在，科研工作者為了獲得精準的試驗結果，首先必須從眾多的內參基因中篩選出穩定的內參基因。geNorm、NormFinder和BestKeeper等是專門用于篩選穩定性內參基因的軟件，但這3種軟件使用方法差異很大，為了讓更多的科研人員了解這些軟件、節省時間，筆者結合自己的科研經驗詳細介紹了這3種軟件的使用方法，以期為相關科研人員利用這些軟件篩選內參基因提供便利。
關鍵詞內參基因；穩定性分析；geNorm；NormFinder；BestKeeper
中圖分類號S60文獻標識碼A文章編號1007-5739（2017）05-0278-04
? ? SYBR Green I 是一種結合于所有 dsDNA 雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的熒光染料， 可與所有的各種序列的雙鏈 DNA 分子結合。 在 游離狀態 下，SYBR Green I 發出 微弱的熒光 ，但 一旦與雙鏈 DNA 結合 ， 嵌入至 dsDNA， 熒光大大增強 。
? ? 因此， SYBR Green I 的熒光信號強度與雙鏈 DNA 的數量相關， PCR 擴增不同時期中， dsDNA 含量不同， SYBR Green I 熒光信號強度不同。 可以根據熒光信號檢測出 PCR 體系存在的雙鏈 DNA 數量， 并可根據對照進行相關的計算和分析。
實驗開始前，需準備好實驗所需的各種試劑和耗材。
試劑包括：特異性 PCR 引物，新鮮提取備用的總 RNA。
使用的試劑盒有：用于合成 cDNA 第一鏈的羅氏試劑盒 Transcriptor FirstStrand cDNA Synthesis Kit，包含了 cDNA 反應所需要的所有實驗組分以及相關的正對照反應組分。
配套 LightCycler? 480 使用的試劑盒 LightCycler? 480 SYBR Green I Master，包含了 PCR 所需的各種實驗組分，如 1 號管中包含熱啟動 Taq DNA Polymerase及反應緩沖液， dNTP mix， SYBR Green I 染料和 MgCl2正式試驗開始前，冰上解凍各個試劑及試劑盒組分，置于冰上待用。 注意：SYBR Green I Master 需避光放置。
所需儀器與耗材有：羅氏 LightCycler? 480 全自動實時定量 PCR 儀以及配套使用的 96 或 384 多孔板，透明封板膜等一次性耗材。賽默飛公司提供的 Thermo Scientific Arktik PCR 儀、單道移液器、 Nunc 冰盒及 QSP 盒裝吸頭等。
接下來進入實驗部分，本實驗操作流程是：首先用新鮮提取的 RNA 反轉錄合成 cDNA 第一鏈，然后進行實時熒光定量 PCR，其中包括： SYBR Green 反應體系的配置； PCR 程序設置； 運行 PCR 實驗，樣品編輯和結果分析。
首先是反轉錄合成 cDNA 第一鏈：
實驗操作時注意：所有 RNA 相關的操作均要佩戴手套，防止 RNase 污染。相關操作嚴格按照試劑盒使用說明進行相關操作。
按照體系配方在冰上的 Rnase free 的滅菌 PCR 管中配置 Template primer mix，總體系 13μl，本實驗是聯合使用 anchored oligo dT 引物和隨機六聚體引物進行的反轉錄。 先配置 NTC 對照，加入 9 號管水 10μl、 6 號管的 50mM oligo dT 引物 1μl、 5 號管的 0.6mM 隨機六聚體引物 2μl，混勻。 然后進行樣品一號管的體系配置， 依次加入 1μl 已調整濃度的總 RNA、 1μl oligo dT 引物、 2μl 隨機六聚體引物、最后加 9μl 水補充至總體積 13μl，混勻。其他樣品管，參照 1 號管的配置方法，依次加好反應體系。注意：可將總 RNA的模板量適當調整至 10ng-5μg，mRNA調整至 1-100ng。
若 RNA 樣品濃度較低，則可加入 10μg/ml 的 MS2 RNA 來穩定模板 RNA。
將配好的反應 mix 在 PCR 儀中 65℃變性 10min，可有效減少 RNA 的二級結構。加熱后迅速置于冰上驟冷，放置 5min。在反應 Template primer mix 中按體系配方順序，依次加入以下試劑： 2 號管的 5×反轉錄酶 buffer， 4 號管 dNTP mix， 3 號管 40 U/μl 的 RNase 抑制劑， 1 號管 20 U/μl 的反轉錄酶，最終體積為 20μl。
若樣品數較多，先配置反應 mix 再分裝，小心吸打混合，切勿渦旋振蕩。 混勻后于瞬時離心機上短暫離心，使樣品和反應液落至離心管底部。將離心管放置 PCR 中，根據使用的引物以及目標 mRNA 的片段長度進行程序設置。本實驗反應溫度和時間設置為： 25℃， 10min， 55℃反應 30min。反應完畢后，于 85℃下加熱 5min 滅活反轉錄酶， 再置于冰上停止反應。此反應產物可于 2-8℃存放 1-2h，或在-15 至-25℃下存放更長時間。
cDNA 產物無需進行純化即可用于后續的 PCR 反應。 20μl 的 PCR 反應體系可取 2-5μl cDNA 反應產物進行擴增。此試劑盒中的反轉錄酶具有 RNase H 活性，可以在 cDNA 合成之后去除 RNA 模版，減少其對后續 PCR 的影響。
本部分實驗，我們選用羅氏的 SYBR Green I Master 試劑盒進行基礎的絕對定量分析。
本實驗共設置 5 個標準樣品，包含 1 個標記為 0 的空白對照， 5 個反轉錄樣品，包含 NTC 對照，由于樣品數較多，先配制不含模版的總體系，再分裝為10管，加入各個樣品的模板后，再將每個樣品分裝為 3 個復孔。
按照體系配方分別加入綠色蓋子的 2×Master Mix， 10x Primer 上下游引物，PCR 級別水。 總體系配好后，在用移液槍輕柔吸打均勻，然后分裝為 10 管，每管 55μl。往 10 管中分別加入各個樣品對應的調整好濃度的 cDNA。STD 零加入 6μl 水代替模板，其余 STD 分別加入 6μl 已經逐級稀釋好的標樣模板。 反轉錄樣品分別加入 6μl 濃度調整好的模板 DNA， 包含 NTC。混勻，然后將每個樣按 20μl 每孔分裝至 96 孔板中。用封孔膜蓋好 96 孔板，將多孔板置于合適的離心機中 1500×g 配平離心 2min 將準備好的 96 孔板放置在LightCycler? 480 設備中。
雙擊打開 LightCycler? 480 的 1.5 軟件并登陸，自動進入軟件界面，點擊 new experiment,在 Detection Format 選項中選擇 SYBR Green I 模式, 點擊 OK 完成檢測通道的設定,接下來設置反應體積，對于 96 模塊，反應體系為 10μl-100μl 之間，本實驗是設定 20μl 的反應體系。
在 Program Name 中輸入反應名稱 pre incubation，預變性設定 1 個循環，無需進行熒光的收集，執行的溫度和時間設定為 95℃ 10min，視圖會根據設定進行實時的調整。
點擊增加按鈕，輸入 Amplification，定義擴增循環的次數為 45 次，并選擇熒光的收集功能 Quantification，然后設定 PCR 擴增循環的溫度與時間為 95℃ 10s，點擊增加按鈕，設定退火溫度和時間為 60℃ 10s，以上兩步 Acquisition Mode 都默認選擇 None，繼續點擊增加按鈕，設置延伸溫度和時間為 72℃ 20s，Acquisition Mode 選擇 Single， Ramp Rate 均按自動調整值，無需再設置。
設置溶解曲線，在 Program 中的新的一行中輸入 Melting Curves， 1 個循環數， Analysis Mode 選擇 Melting Curves，時間和溫度設置為 95℃ 5s， 點擊增加按鈕，新增設置溫度和時間為 65℃ 1min，以上兩步 Acquisition Mode 都默認選擇 None。點擊增加按鈕，新增設置溫度為 95℃，Acquisition Mode 選擇 Continuous,其他設置無需改動。
設置保溫的過程 Cooling，只需 1 個循環，無需收集熒光，設定溫度和時間為 40℃、 1min。設置完成后點擊右邊的保存按鈕保存設置的程序。此時整個 PCR的循環體系、溫度的設置已經設定完畢。
點擊 Start run 開始運行 PCR 反應，此時可在軟件上實時監測樣品擴增情況。
實驗結束，點擊 Sample Editor，進入樣本編輯區。
Select Workflow 中選擇 Abs Quant。根據樣本在板中排布的方式進行樣本編輯。設置陰性對照、空白對照、標準品以及未知樣品等。
在 Select Sample 中，選中需要設置的樣品孔。在下一欄中的 Sample Name 輸入被選擇樣品組的名稱，并在 Sample Type 中選擇樣品組的類型，最后點擊 Make Replicates 設置復孔。標準品設置時，需填寫拷貝數，只需填寫好稀釋倍數，初始濃度即可。 編輯好樣品后，即可進行數據分析。如有需要，也可進行子集編輯。
樣品編輯好后，可進行實驗結果分析。
點擊左邊欄下方的 sum 按鈕，相應出現實驗的所有信息，包括：設計的反應程序，實驗結果分析等。
點擊 analysis，可以根據樣品已有的數據進行細致準確地分析。
點擊 Abs Quant second derivative max，彈出 create new analysis 窗口，在 Subset 選項中選擇分析樣品的分布區域，點擊確定，即可出現分析圖：相應樣品的擴增曲線。
Standard Curve 是根據標準品得出的標準曲線，曲線左側標有擴增效率、斜率、截距、線性關系、以及錯誤率。一般“Error”值越小，說明實驗的準確率越高。
擴增效率如果越接近“2”，說明這次的擴增反應越好。
在數據表格，可顯示單個樣本的 Cp 值，以及相應的樣本濃度值。
按復孔進行數據統計，顯示 Cp 平均值，方差，濃度的平均值以及方差。 關于熒光定量數據分析軟件和實時熒光定量分析的介紹到此就結束了，不知道你從中找到你需要的信息了嗎 ？如果你還想了解更多這方面的信息，記得收藏關注本站。 熒光定量數據分析軟件的介紹就聊到這里吧，感謝你花時間閱讀本站內容，更多關于實時熒光定量分析、熒光定量數據分析軟件的信息別忘了在本站進行查找喔。
本文目錄一覽：
- 1、如何利用RG3000和MX3000P兩款熒光定量pcr儀進行相對定量數據分析
- 2、quantstudio3采集不到熒光信號
- 3、quantstudiotm 7 flex實時熒光定量pcr系統能夠識別哪些熒光信號
- 4、最新最好用geNorm、normfinder、bestkeeper 內參基因軟件使用方法
- 5、實時熒光定量 PCR
如何利用RG3000和MX3000P兩款熒光定量pcr儀進行相對定量數據分析
（1）分頁：將不同的引物（基因）分在不同的頁；（2）將來自相同模板的名字一樣，可以定義為1234...；例如： P1（引物）P2P3P4WT：calibratorActin(1)A(1)B(1)C(1)MT1：unknown1Actin(2)A(2)B(2)C(2)MT2：unknown2Actin(3)A(3)B(3)C(3) 說明：（1）P1：引物1，擴增相同的基因；（2）WT：calibrator 對照組樣本，例如：野生型WT（Wild type）；（3）MT：unknown 未知組樣本或處理組樣本或待測組樣本，例如突變型MT（Mutant type）。 數據分析時，選用Quantation 直接出原始圖；選用2-△△Ct方法，然后根據提示選擇：Analysis - Others - Delta Delta CT Relative Quatatition - validation performed、Gene Interest Quantitation 、Normalizer Quantitation 和Calibrator Defined 出相對定量柱狀圖；選擇2 Standard Curves Relative Quantitation ，然后根據提示選擇：Gene Interest StandardCurve、Normalizer Stard Curve和Calibrator Defined 出相對定量柱狀圖。 2、MX3000P熒光定量PCR儀：軟件：MxPro根據樣本來源和待擴增基因分類如下：Assoc.symbolSample：樣本來源NormalizerGene of InterestGene of InterestAWT（Calibrator對照組）ActinGene1Gene2BMT1 (unknown1待測組)ActinGene1Gene2CMT2 (unknown2待測組)ActinGene1Gene2DMT3 (unknown3待測組)ActinGene1Gene2EMT4 (unknown4待測組)ActinGene1Gene2操作步驟：進入軟件主頁 --- 選擇“comparative quantitation” --- well type 選擇（Calibrator：如WT；Unknown：如MT）--- 選擇：sybr / reference：rox --- 選擇Normalizeing assay（看家/內參基因組） --- 然后將選擇Assoc.symbol將相同樣本來源的樣品孔綁定起來；擴增程序設計；結果分析：選定Calibrator 和 Unknown組的內參基因和感興趣基因，結果分析即可得到柱狀圖。quantstudio3采集不到熒光信號
系統bug。在使用quantstudio3系統人時，采集不到熒光信號是該系統bug導致的，只需要重新系統即可。QuantStudio3?是一款高性價比的實時熒光定量PCR系統，適合各種經驗水平的用戶。互動的觸摸屏、簡單易用的軟件、預先優化的運行程序模板、以及基于網絡瀏覽器的云服務平臺（隨時隨地連接，分析，共享數據），QuantStudio3?為您提供極佳的體驗和數據結果。
quantstudiotm 7 flex實時熒光定量pcr系統能夠識別哪些熒光信號
更快地獲得更豐富的結果該儀器采用集成Twister?機械臂的TaqMan?微流體芯片，可以輕松進行數百次實時定量PCR反應。QuantStudio? 7 Flex系統可助您最大限度提高自動化輸出能力。
兼容各類應用
優化的實驗方案和試劑與直觀的軟件相結合，兼容最廣泛的應用。
獲得值得信賴的結果
OptiFlexTM系統擁有六組分離的激發與發射濾片和21片濾片組合，能夠確保最高的多重分析能力和化學反應靈活性，提高孔與孔之間、儀器與儀器之間的數據精確性。
1. 主要技術要求
1.1 *內置96孔模塊，可升級96孔快速模塊及384孔模塊；
1.2 *開放5通道檢測，連續波長檢測，另外可以升級至6色激發光通道和6色檢測光通道及21色熒光；
1.3 采用檢測光濾光片分光，熒光通道開放，用戶可自行添加熒光種類；
1.4 *冷CCD檢測器96孔/384同步成像；
1.5 *最高升降溫速率均可達到：6.5°C/秒；
1.6 *溫控范圍：4～99.9°C；
1.7 動力學線性范圍：檢測10個起始拷貝，101~109九個數量級，致信度99.7%。區分度要有裝機試劑盒驗證：能分辨1250、2500、5000、10000、20000拷貝數的初始模板標準品各4個重復驗證線性準確度，36個重復的5000拷貝和36個重復的10000拷貝能以99.7%的置信度加以區；
1.8 *有防系統誤差方法可供用戶選擇:內參比熒光Rox,校正加樣誤差和管間差異；
1.9 可分辨單位細胞起始拷貝數1~5拷貝之間的樣本99.7%置信度；
1.10 *可分辨起始拷貝數200與300的樣本（0.5倍差異）；可實現單拷貝起始模板的區分；
1.11 *高能量合金鹵素燈激發,單個光源壽命不低于2000小時；
1.12 可升級HRM（高分辨率熔解曲線）分析系統，用于高通量篩選分析單核酸多態性位點（SNP）, 高分辨熔解曲線分辨率： 低至 0.04°C；
1.13 支持35分鐘以內完成40循環的快速熒光定量PCR實驗；
1.14 軟件組成：
1.14.1 配備完備的定量PCR軟件,等位基因分析軟件。原廠的探針及引物設計軟件，可用于PCR引物，巢式PCR，多重PCR引物，RT-PCR引物和Taqman探針的設計和自動測試；
1.14.2 可配備相對定量基因表達軟件，可同時對無限個數據進行自動的分析、比對、作出柱狀圖，用于基因表達，藥物療效考核等相對定量分析；
1.14.3 配備完備的定量PCR軟件,等位基因（SNP）分析軟件和陰陽性結果自動判定軟件；
1.15 試劑耗材開放；
1.15.1 可提供原廠人類、大鼠、小鼠、果蠅和擬南芥等多種模式生物全基因組范圍表達試劑盒基因表達試劑盒（試劑盒包含:正/反向引物，TaqMan探針，）且同一PCR條件；
1.15.2 可提供原廠人類、大鼠、小鼠、果蠅和擬南芥等模式生物microRNA檢測試劑盒（試劑盒包含:正/反向引物，TaqMan探針，）且同一PCR條件；
1.15.3 支持耗材：國際標準96孔 (0.2 mL) 反應板與光學蓋膜，0.2 mL八連管，0.2mL單管；
1.16 內置觸摸屏電腦：觸摸屏電腦可備份還原超過100次的實驗數據,可快速地設置多種應用；
*1.17 原裝進口。
最新最好用geNorm、normfinder、bestkeeper 內參基因軟件使用方法
實時熒光定量PCR（RT-qPCR）由于具備靈敏度高、重復性好、特異性強及高通量等優點，已經成為研究基因表達分析的常用方法[1-2]。實時熒光定量PCR分為絕對定量和相對定量，在進行相對定量分析時不需要已知量的標準品，因而該方法被經常運用，但該方法需要用內參基因對目的基因進行數據校正，才能獲得精確的結果[3-4]。肌動蛋白基因（ACT）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPD H）、18S rRNA、轉錄延伸因子基因（EF-1α）、多聚泛素酶基因（UBQ）、α微管蛋白基因（TUA）和β微管蛋白基因（TUB）等看家基因在之前的研究中常常被當作內參基因進行使用[5-8]。然而，越來越多的研究表明，在某種試驗穩定表達的內參基因，在另一種試驗中有可能是變化的[9-11]，而在任何試驗條件下都能穩定表達的內參基因幾乎不存在[12-13]。如果僅僅根據文獻報道使用某個常用的內參基因，不僅可能導致試驗結果的不準確性，甚至可能導致結論的錯誤。因此，本著嚴謹的科學態度，科研工作者首先必須從眾多的內參基因中篩選出在各自試驗條件下較為穩定的內參基因。
geNorm、NormFinder和BestKeeper是專門用于篩選內參基因穩定性的軟件，但這3種軟件的使用方法和分析的側重點各不一樣，為了讓相關科研人員快速了解并掌握這3種軟件的使用方法，筆者結合自身使用這些軟件的經歷，詳細介紹了這3種軟件的使用要點，以期為相關科研人員分析內參基因穩定性提供便利。
1geNorm軟件
1.1軟件概述
geNorm軟件是Vandesompele等[14]在2002年編寫的專門用于實時熒光定量PCR中篩選內參基因及確定最適內參基因數目的程序，該程序可以用于篩選任何試驗的任意數目的內參基因，并最終挑選出2個或2個以上的內參基因組合來校正數據，可使相對定量的結果更為精確。geNorm 程序通過計算出每個內參基因穩定性的M值來篩選出穩定性較好的內參基因，判定標準為M值越小內參基因穩定性越好，反之，則穩定性越差。該軟件還可計算引入1個新的內參基因后標準化因子的配對變異V值，并根據V n/V n+1值來確定所需最適內參基因的數目。默認的V值為0.15（該值可以人為稍作調整），如果V n/V n+1值<0.15，則最適內參基因的數量是n個；而如果V n/V n+1值0.15，則最適內參基因的數量是n+1個。
1.2操作流程
1.2.1修改Excel表格安全性級別。若geNorm軟件打開后不能正常運行時，可能是由于Excel表格默認宏的安全性級別設置的比較高，這時需要將Excel表格安全性級別更改到最低級別。更改方法為點擊Excel表格中的“工具”按鈕，然后點擊其下拉菜單“宏”的子菜單“安全性”選項，在彈出來的“安全性”對話框中將安全級別設置為最低。
1.2.2計算△Ct值。先找到該基因在所有樣品中最小的Ct （Cycle threshold）值（表達量最高），再用其他樣品的Ct值減
利用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件進行內參基因穩定性
分析的方法
吳建陽1何冰1杜玉潔1李偉才2魏永贊2*
（1嶺南師范學院基礎教育學院，廣東湛江524037；2農業部熱帶果樹生物學重點實驗室，中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所）摘要實時熒光定量PCR（RT-qPCR）由于具備靈敏度高、重復性好、特異性強及高通量等優點，已經成為研究基因表達分析的常用方
法，但其結果的準確性取決于內參基因。在任何試驗條件下都能穩定表達的內參基因幾乎不存在，科研工作者為了獲得精準的試驗結果，首先必須從眾多的內參基因中篩選出穩定的內參基因。geNorm、NormFinder和BestKeeper等是專門用于篩選穩定性內參基因的軟件，但這3種軟件使用方法差異很大，為了讓更多的科研人員了解這些軟件、節省時間，筆者結合自己的科研經驗詳細介紹了這3種軟件的使用方法，以期為相關科研人員利用這些軟件篩選內參基因提供便利。
關鍵詞內參基因；穩定性分析；geNorm；NormFinder；BestKeeper
中圖分類號S60文獻標識碼A文章編號1007-5739（2017）05-0278-04
實時熒光定量 PCR
實時熒光定量 PCR ，簡稱 RT-QPCR, 屬于 Q-PCR 的一種，目前該技術已得到廣泛應用，如：擴增特異性分析、基因定量分析、基因分型、 SNP 分析等。熒光定量 PCR 常用的方法是 DNA 結合染料 SYBR GreenⅠ的非特異性方法。? ? SYBR Green I 是一種結合于所有 dsDNA 雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的熒光染料， 可與所有的各種序列的雙鏈 DNA 分子結合。 在 游離狀態 下，SYBR Green I 發出 微弱的熒光 ，但 一旦與雙鏈 DNA 結合 ， 嵌入至 dsDNA， 熒光大大增強 。
? ? 因此， SYBR Green I 的熒光信號強度與雙鏈 DNA 的數量相關， PCR 擴增不同時期中， dsDNA 含量不同， SYBR Green I 熒光信號強度不同。 可以根據熒光信號檢測出 PCR 體系存在的雙鏈 DNA 數量， 并可根據對照進行相關的計算和分析。
實驗開始前，需準備好實驗所需的各種試劑和耗材。
試劑包括：特異性 PCR 引物，新鮮提取備用的總 RNA。
使用的試劑盒有：用于合成 cDNA 第一鏈的羅氏試劑盒 Transcriptor FirstStrand cDNA Synthesis Kit，包含了 cDNA 反應所需要的所有實驗組分以及相關的正對照反應組分。
配套 LightCycler? 480 使用的試劑盒 LightCycler? 480 SYBR Green I Master，包含了 PCR 所需的各種實驗組分，如 1 號管中包含熱啟動 Taq DNA Polymerase及反應緩沖液， dNTP mix， SYBR Green I 染料和 MgCl2正式試驗開始前，冰上解凍各個試劑及試劑盒組分，置于冰上待用。 注意：SYBR Green I Master 需避光放置。
所需儀器與耗材有：羅氏 LightCycler? 480 全自動實時定量 PCR 儀以及配套使用的 96 或 384 多孔板，透明封板膜等一次性耗材。賽默飛公司提供的 Thermo Scientific Arktik PCR 儀、單道移液器、 Nunc 冰盒及 QSP 盒裝吸頭等。
接下來進入實驗部分，本實驗操作流程是：首先用新鮮提取的 RNA 反轉錄合成 cDNA 第一鏈，然后進行實時熒光定量 PCR，其中包括： SYBR Green 反應體系的配置； PCR 程序設置； 運行 PCR 實驗，樣品編輯和結果分析。
首先是反轉錄合成 cDNA 第一鏈：
實驗操作時注意：所有 RNA 相關的操作均要佩戴手套，防止 RNase 污染。相關操作嚴格按照試劑盒使用說明進行相關操作。
按照體系配方在冰上的 Rnase free 的滅菌 PCR 管中配置 Template primer mix，總體系 13μl，本實驗是聯合使用 anchored oligo dT 引物和隨機六聚體引物進行的反轉錄。 先配置 NTC 對照，加入 9 號管水 10μl、 6 號管的 50mM oligo dT 引物 1μl、 5 號管的 0.6mM 隨機六聚體引物 2μl，混勻。 然后進行樣品一號管的體系配置， 依次加入 1μl 已調整濃度的總 RNA、 1μl oligo dT 引物、 2μl 隨機六聚體引物、最后加 9μl 水補充至總體積 13μl，混勻。其他樣品管，參照 1 號管的配置方法，依次加好反應體系。注意：可將總 RNA的模板量適當調整至 10ng-5μg，mRNA調整至 1-100ng。
若 RNA 樣品濃度較低，則可加入 10μg/ml 的 MS2 RNA 來穩定模板 RNA。
將配好的反應 mix 在 PCR 儀中 65℃變性 10min，可有效減少 RNA 的二級結構。加熱后迅速置于冰上驟冷，放置 5min。在反應 Template primer mix 中按體系配方順序，依次加入以下試劑： 2 號管的 5×反轉錄酶 buffer， 4 號管 dNTP mix， 3 號管 40 U/μl 的 RNase 抑制劑， 1 號管 20 U/μl 的反轉錄酶，最終體積為 20μl。
若樣品數較多，先配置反應 mix 再分裝，小心吸打混合，切勿渦旋振蕩。 混勻后于瞬時離心機上短暫離心，使樣品和反應液落至離心管底部。將離心管放置 PCR 中，根據使用的引物以及目標 mRNA 的片段長度進行程序設置。本實驗反應溫度和時間設置為： 25℃， 10min， 55℃反應 30min。反應完畢后，于 85℃下加熱 5min 滅活反轉錄酶， 再置于冰上停止反應。此反應產物可于 2-8℃存放 1-2h，或在-15 至-25℃下存放更長時間。
cDNA 產物無需進行純化即可用于后續的 PCR 反應。 20μl 的 PCR 反應體系可取 2-5μl cDNA 反應產物進行擴增。此試劑盒中的反轉錄酶具有 RNase H 活性，可以在 cDNA 合成之后去除 RNA 模版，減少其對后續 PCR 的影響。
本部分實驗，我們選用羅氏的 SYBR Green I Master 試劑盒進行基礎的絕對定量分析。
本實驗共設置 5 個標準樣品，包含 1 個標記為 0 的空白對照， 5 個反轉錄樣品，包含 NTC 對照，由于樣品數較多，先配制不含模版的總體系，再分裝為10管，加入各個樣品的模板后，再將每個樣品分裝為 3 個復孔。
按照體系配方分別加入綠色蓋子的 2×Master Mix， 10x Primer 上下游引物，PCR 級別水。 總體系配好后，在用移液槍輕柔吸打均勻，然后分裝為 10 管，每管 55μl。往 10 管中分別加入各個樣品對應的調整好濃度的 cDNA。STD 零加入 6μl 水代替模板，其余 STD 分別加入 6μl 已經逐級稀釋好的標樣模板。 反轉錄樣品分別加入 6μl 濃度調整好的模板 DNA， 包含 NTC。混勻，然后將每個樣按 20μl 每孔分裝至 96 孔板中。用封孔膜蓋好 96 孔板，將多孔板置于合適的離心機中 1500×g 配平離心 2min 將準備好的 96 孔板放置在LightCycler? 480 設備中。
雙擊打開 LightCycler? 480 的 1.5 軟件并登陸，自動進入軟件界面，點擊 new experiment,在 Detection Format 選項中選擇 SYBR Green I 模式, 點擊 OK 完成檢測通道的設定,接下來設置反應體積，對于 96 模塊，反應體系為 10μl-100μl 之間，本實驗是設定 20μl 的反應體系。
在 Program Name 中輸入反應名稱 pre incubation，預變性設定 1 個循環，無需進行熒光的收集，執行的溫度和時間設定為 95℃ 10min，視圖會根據設定進行實時的調整。
點擊增加按鈕，輸入 Amplification，定義擴增循環的次數為 45 次，并選擇熒光的收集功能 Quantification，然后設定 PCR 擴增循環的溫度與時間為 95℃ 10s，點擊增加按鈕，設定退火溫度和時間為 60℃ 10s，以上兩步 Acquisition Mode 都默認選擇 None，繼續點擊增加按鈕，設置延伸溫度和時間為 72℃ 20s，Acquisition Mode 選擇 Single， Ramp Rate 均按自動調整值，無需再設置。
設置溶解曲線，在 Program 中的新的一行中輸入 Melting Curves， 1 個循環數， Analysis Mode 選擇 Melting Curves，時間和溫度設置為 95℃ 5s， 點擊增加按鈕，新增設置溫度和時間為 65℃ 1min，以上兩步 Acquisition Mode 都默認選擇 None。點擊增加按鈕，新增設置溫度為 95℃，Acquisition Mode 選擇 Continuous,其他設置無需改動。
設置保溫的過程 Cooling，只需 1 個循環，無需收集熒光，設定溫度和時間為 40℃、 1min。設置完成后點擊右邊的保存按鈕保存設置的程序。此時整個 PCR的循環體系、溫度的設置已經設定完畢。
點擊 Start run 開始運行 PCR 反應，此時可在軟件上實時監測樣品擴增情況。
實驗結束，點擊 Sample Editor，進入樣本編輯區。
Select Workflow 中選擇 Abs Quant。根據樣本在板中排布的方式進行樣本編輯。設置陰性對照、空白對照、標準品以及未知樣品等。
在 Select Sample 中，選中需要設置的樣品孔。在下一欄中的 Sample Name 輸入被選擇樣品組的名稱，并在 Sample Type 中選擇樣品組的類型，最后點擊 Make Replicates 設置復孔。標準品設置時，需填寫拷貝數，只需填寫好稀釋倍數，初始濃度即可。 編輯好樣品后，即可進行數據分析。如有需要，也可進行子集編輯。
樣品編輯好后，可進行實驗結果分析。
點擊左邊欄下方的 sum 按鈕，相應出現實驗的所有信息，包括：設計的反應程序，實驗結果分析等。
點擊 analysis，可以根據樣品已有的數據進行細致準確地分析。
點擊 Abs Quant second derivative max，彈出 create new analysis 窗口，在 Subset 選項中選擇分析樣品的分布區域，點擊確定，即可出現分析圖：相應樣品的擴增曲線。
Standard Curve 是根據標準品得出的標準曲線，曲線左側標有擴增效率、斜率、截距、線性關系、以及錯誤率。一般“Error”值越小，說明實驗的準確率越高。
擴增效率如果越接近“2”，說明這次的擴增反應越好。
在數據表格，可顯示單個樣本的 Cp 值，以及相應的樣本濃度值。
按復孔進行數據統計，顯示 Cp 平均值，方差，濃度的平均值以及方差。 關于熒光定量數據分析軟件和實時熒光定量分析的介紹到此就結束了，不知道你從中找到你需要的信息了嗎 ？如果你還想了解更多這方面的信息，記得收藏關注本站。 熒光定量數據分析軟件的介紹就聊到這里吧，感謝你花時間閱讀本站內容，更多關于實時熒光定量分析、熒光定量數據分析軟件的信息別忘了在本站進行查找喔。
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