測(cè)序數(shù)據(jù)分析軟件(測(cè)序數(shù)據(jù)處理)

      網(wǎng)友投稿 1621 2022-12-21

      本篇文章給大家談?wù)劀y(cè)序數(shù)據(jù)分析軟件,以及測(cè)序數(shù)據(jù)處理對(duì)應(yīng)的知識(shí)點(diǎn),希望對(duì)各位有所幫助,不要忘了收藏本站喔。 今天給各位分享測(cè)序數(shù)據(jù)分析軟件的知識(shí),其中也會(huì)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)處理進(jìn)行解釋,如果能碰巧解決你現(xiàn)在面臨的問題,別忘了關(guān)注本站,現(xiàn)在開始吧!

      本文目錄一覽:

      【生信知識(shí)】---Nanopore測(cè)序分析軟件nanopolish

      前言: nanopolish是開源的綜合性分析軟件,集成了非常多的三代測(cè)序數(shù)據(jù)分析小工具。

      1.軟件安裝:
      通過Github源碼安裝:

      或者,通過conda安裝:

      2.主要功能:

      構(gòu)建索引

      與參考基因組比對(duì)

      利用nanopolish檢測(cè)甲基化位點(diǎn)

      對(duì)結(jié)果進(jìn)行過濾

      TBtools | 基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)分析常用上游軟件「三兄弟」,聚齊了~

      是的,最后,我選擇了「一條路走到黑」~ 咱們先不管一些人如何看,東西先整出來。大體如下。

      沒錯(cuò)。從「原始測(cè)序數(shù)據(jù)」到「SNP Calling」,也就是 從 .fastq 到 .vcf,一套聚齊了。其中涉及到三個(gè)目前最常用的軟件:

      有了這三個(gè)插件,所有的「TBtools」用戶,可以在 Windows 或者 MacOS 下,點(diǎn)點(diǎn)點(diǎn),分析自己想分析的數(shù)據(jù)。當(dāng)然,時(shí)間成本前面有提到,最好是按照至少一天跑一個(gè)樣品來算。做做 BSAseq 或者少數(shù)兩三個(gè)樣品還是可以的。大的群體,那么就可能需要足夠好配置的機(jī)器....這個(gè)暫時(shí)不是咱們要考慮的事情。
      前兩個(gè)插件都介紹過了。今天介紹「BCFtools GUI Wrapper」,整體如下。

      一次包括兩個(gè)功能,變異檢測(cè)和變異過濾。

      從界面來看,比較簡(jiǎn)單。只需要將 MarkDup.PositionSorted.bam 都拖拽放置進(jìn)去就可以了。

      邏輯上需要等一些時(shí)間,可以得到初步的 bcf 文件。

      「SNP Calling」之后,幾乎所有情況下,都會(huì)做下一步過濾。具體過濾參數(shù)會(huì)對(duì)后續(xù)分析產(chǎn)生一定的影響。此處,默認(rèn)給了一個(gè)相對(duì)嚴(yán)格的過濾參數(shù),盡量保留「真陽性」SNP。具體使用方法如下。

      簡(jiǎn)單來說...就是把文件放進(jìn)去,然后設(shè)置一下輸出目錄,最后點(diǎn)擊「Start」即可。

      基本完事。三個(gè)「玩具」,歡迎「試玩」。我覺得,BSAseq真的可以試試了。因?yàn)橛辛?VCF 之后,剩下的其實(shí)就是一個(gè) R包 的事兒。這個(gè)就用 R-Plugin 了。而如果你的 PC 真的強(qiáng),你甚至還可以用搞 GWAS,因?yàn)橛辛?VCF,剩下的不就是? R 包嗎?

      10X單細(xì)胞測(cè)序之cellranger介紹

      ??目前10X單細(xì)胞測(cè)序算是測(cè)序行業(yè)最熱門測(cè)序數(shù)據(jù)分析軟件的方向之一,它可以在低測(cè)序深度測(cè)序數(shù)據(jù)分析軟件的情況下一次性的獲得成千上萬的細(xì)胞及其每個(gè)細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)情況,對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)分析軟件了解細(xì)胞異質(zhì)性和新的細(xì)胞類型非常有利。官網(wǎng)介紹的功能和優(yōu)勢(shì)如下測(cè)序數(shù)據(jù)分析軟件

      ??既然10X單細(xì)胞優(yōu)勢(shì)這么大,那么了解它數(shù)據(jù)的分析過程就十分有必要。單細(xì)胞分析的內(nèi)容主要包括數(shù)據(jù)拆分、細(xì)胞定量、降維聚類、差異、富集和注釋。這次我們主要討論10X GENOMICS公司為單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組量身打造的軟件——cellranger。這款軟件能幫助我們實(shí)現(xiàn)分析內(nèi)容的前兩部步,其中還有最重要的一步——定量。

      ??cellranger功能強(qiáng)大,像數(shù)據(jù)拆分 cellranger mkfastq 、細(xì)胞定量 cellranger count 、組合分析 cellranger aggr 、二次分析 cellranger reanalyze 等分析都可以完成。

      ??在測(cè)序過程中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)文庫上同一個(gè)lane,或者一個(gè)文庫上不同lane的情況,對(duì)于這種情況,使用cellranger的mkfastq工具就可以實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的拆分。有以下兩種運(yùn)行方式:

      ??該命令其實(shí)是對(duì)illumina提供的拆分?jǐn)?shù)據(jù)的bcl2fastq命令的一個(gè)封裝,需要樣本名稱,index等信息,支持兩種格式,一種就是illlumina常規(guī)的samplesheet.csv文件,還有一種是10X genomics定制的一種簡(jiǎn)化版的csv格式。第一種如下所示,格式復(fù)雜:

      ??第二種含有三列信息,一列指定lane ID, 第二列指定樣本名稱,第三列指定index的名稱,10X genomics的每個(gè)index代表4條具體的oligo序列。推薦使用第二種簡(jiǎn)化版的csv文件,因?yàn)閏ell ranger可以識(shí)別所用試劑盒版本,然后自動(dòng)化的調(diào)整reads長(zhǎng)度。

      ??拆分好后的目錄結(jié)果如下:

      ??如果手里頭數(shù)據(jù)已經(jīng)是拆分好的fq.gz數(shù)據(jù),就可以直接進(jìn)行該部分分析。cellranger提供count工具實(shí)現(xiàn)測(cè)序數(shù)據(jù)中細(xì)胞和基因的定量,產(chǎn)生后續(xù)分析用到的基因表達(dá)矩陣,運(yùn)行方式如下:

      ??輸出文件夾內(nèi)容:

      ??對(duì)于這個(gè)功能, 官網(wǎng) 如此介紹:當(dāng)進(jìn)行涉及多個(gè)GEM Well的大型研究時(shí),運(yùn)行cellranger請(qǐng)分別從每個(gè)GEM Well收集fastq數(shù)據(jù),然后使用cellranger aggr匯集結(jié)果。也就是說,需要分樣進(jìn)行cellranger count分析,然后再使用aggr進(jìn)行合并。

      ??csv文件需要兩列文件,第一列是GEM well唯一的標(biāo)識(shí)ID,第二列是運(yùn)行count產(chǎn)生的molecule_info.h5文件,格式如下:

      ??輸出結(jié)果,目錄結(jié)構(gòu)和count基本一致:

      ??如果第一次count分析結(jié)果不理想,如檢測(cè)到的reads大部分不在細(xì)胞中,可以在二次分析中調(diào)參數(shù)重新分析,并且使用的數(shù)據(jù)不再是fq.gz數(shù)據(jù),速度更快,使用方法:

      ??輸出結(jié)果如下:

      使用cell ranger拆分10X單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)
      10X單細(xì)胞測(cè)序分析軟件:Cell ranger

      kmer分析的幾款軟件介紹

      1.jellyfish

      運(yùn)行jellyfish

      2.使用 GCE 進(jìn)行基因組大小評(píng)估

      GCE 軟件包中主要包含 kmer_freq_hash 和 gce 兩支程序。前者用于進(jìn)行 kmer 的頻數(shù)統(tǒng)計(jì),后者在前者的結(jié)果上進(jìn)行基因組大小的準(zhǔn)確估算。

      kmer_freq_hash 的常用參數(shù):

      運(yùn)行kmer_freq_hash:

      kmer_freq_hash 的主要結(jié)果文件為 species.freq.stat。該文件有 2 列:第1列是kmer重復(fù)的次數(shù),第二列是kmer的種類數(shù)。該文件有255行,第225行表示kmer重復(fù)次數(shù)=255的kmer的總的種類數(shù)。該文件作為 gce 的輸入文件。
      kmer_freq_hash 的輸出到屏幕上的信息結(jié)果保存到文件 kmer_freq.log 文件中。該文件中有粗略估計(jì)基因組的大小。其中的 Kmer_individual_num 數(shù)據(jù)作為 gce 的輸入?yún)?shù)。

      gce 的使用:

      參數(shù)說明:

      gce 的結(jié)果文件為 species.table 和 species.log 。species.log 文件中的主要內(nèi)容:

      如果使用 -H 1 參數(shù),則會(huì)得額外得到如下信息:

      則雜合率 = 0.0580297 / kmer_size 。 若計(jì)算出的雜合率低于 0.2%,個(gè)人認(rèn)為測(cè)序數(shù)據(jù)應(yīng)該是純合的。這時(shí)候,應(yīng)該不使用 -H 1 參數(shù)。使用 -H 1 參數(shù)會(huì)對(duì)基因組的大小和重復(fù)序列含量估算造成影響。

      參考: https://www.plob.org/article/9388.html

      3.KmerFreq_AR計(jì)算基因組大小

      單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析--初探Seurat

      時(shí)代發(fā)展的步伐總是毫不留情的將你甩在身后,連車尾燈都看不見。當(dāng)你還在沉迷于普通轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘時(shí),已經(jīng)有人悄悄的搞上單細(xì)胞了。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,顧名思義就是在單個(gè)細(xì)胞的分辨率基礎(chǔ)上去研究細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)等,其主要目的是為了研究不同細(xì)胞類型的基因表達(dá)異質(zhì)性,從而解決相關(guān)生物學(xué)問題。談到單細(xì)胞就不得不提一下當(dāng)下火爆的10x Genomics服務(wù)商了,具體參見 10x Genomics 。本篇文章暫時(shí)不介紹10x,主要介紹單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析軟件Seurat。
      Seurat軟件是一個(gè)R包,可以說是單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析的明星軟件,很多單細(xì)胞測(cè)序文章都會(huì)引用該軟件,引用次數(shù)也是杠杠的,而且也有詳細(xì)的 在線教程 。本文也主要是根據(jù)其教程介紹一下使用Seurat軟件分析一個(gè)樣本的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的步驟及注意事項(xiàng),供大家討論。
      導(dǎo)入分析需要的包

      Seurat軟件提供了很友好的函數(shù)可以直接讀取10x Genomics的輸出結(jié)果

      導(dǎo)入文件后便可以創(chuàng)建Seurat對(duì)象

      創(chuàng)建完Seurat對(duì)象后,Seurat將數(shù)據(jù)保存在不同的slot中,如filter_10x_object@raw.data, filter_10x_objectt@data, filter_10x_object@meta.data, filter_10x_object@ident,其中raw.data存放的是每個(gè)細(xì)胞中每個(gè)gene的原始UMI數(shù)據(jù),data存放的是gene的表達(dá)量,meta.data存放的是每個(gè)細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)如UMI數(shù)目,gene數(shù)目等,ident此時(shí)存放的是project信息。

      由于技術(shù)原因,一個(gè)GEM中可能會(huì)包含2個(gè)或多個(gè)細(xì)胞,也可能不包含細(xì)胞,這時(shí)候可以通過觀察每個(gè)barcode中的基因數(shù)目或UMI數(shù)目來判斷。

      上圖展示的是每個(gè)barcode中的基因數(shù)目和UMI數(shù)目的關(guān)系,一般二者都成正相關(guān)關(guān)系,有個(gè)別barcode的基因數(shù)目和UMI數(shù)目過高,有可能就是包含2個(gè)細(xì)胞的GEM,可以考慮在后續(xù)分析中將其過濾掉。
      我們不僅僅可以觀察每個(gè)barcode的基因數(shù)目,還可以計(jì)算每個(gè)barcode中的線粒體基因含量等,從而更加仔細(xì)的觀察數(shù)據(jù)的質(zhì)量。

      這張圖片展示了每個(gè)barcode中基因數(shù)目、UMI數(shù)目以及線粒體基因含量的分布情況,根據(jù)上述2張圖片就可以大致確定是否需要過濾哪些數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。
      Seurat提供了一個(gè)很好用的數(shù)據(jù)過濾函數(shù):

      以上就是數(shù)據(jù)的預(yù)處理過程了,接下來就進(jìn)入正式的分析階段,包括數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化、歸一化、數(shù)據(jù)降維以及聚類分析等。

      FindVariableGenes算法:首先計(jì)算基因的平均表達(dá)量,然后計(jì)算基因的離散度;接下來根據(jù)平均表達(dá)值將基因分成20塊并計(jì)算每塊的離散度的Z值。
      如上圖:橫坐標(biāo)代表基因的平均表達(dá)量,縱坐標(biāo)代表基因的離散度的Z值,標(biāo)有基因名的點(diǎn)就是由函數(shù)中的cutoff值決定的,改變cutoff值,這些標(biāo)記也會(huì)隨之改變。
      數(shù)據(jù)的線性回歸、中心化和比例化:對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析,去除不想要的變異源。
      中心化:首先計(jì)算基因A在所有細(xì)胞中的平均表達(dá)量,然后分別將每個(gè)細(xì)胞中基因A的表達(dá)值減去平均值。
      比例化:在中心化的基礎(chǔ)上,首先計(jì)算基因A在所有細(xì)胞中的中心化值后的標(biāo)準(zhǔn)差,然后分別將每個(gè)細(xì)胞中基因A的中心化值除以標(biāo)準(zhǔn)差。這些步驟都在一個(gè)函數(shù)中完成。

      單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)是數(shù)萬個(gè)基因在數(shù)萬個(gè)細(xì)胞中的表達(dá)情況,屬于典型的高維數(shù)據(jù)。如果把1個(gè)基因視為1個(gè)坐標(biāo)軸的話,那么一個(gè)細(xì)胞的空間位置就是在數(shù)萬個(gè)坐標(biāo)軸中的定位,這樣的話相同細(xì)胞類型的細(xì)胞就應(yīng)該挨在一起,我們就可以根據(jù)細(xì)胞的空間位置判斷細(xì)胞亞群了。可是我最多也就認(rèn)識(shí)三維坐標(biāo)啊,咋辦,能不能把這些高維數(shù)據(jù)投影到二維坐標(biāo)呢,那就交給PCA和t-SNE吧。PCA和tSNE都是數(shù)據(jù)降維分析方法,PCA屬于線性降維,tSNE屬于非線性降維。我們先執(zhí)行PCA分析,使高維數(shù)據(jù)的信息最大程度保留在低維數(shù)據(jù)中,PCA分析利用的是保存在scale.data的值。

      執(zhí)行完P(guān)CA分析后,就要根據(jù)PCA得分來進(jìn)行聚類分析了,但是在進(jìn)行聚類分析之前,需要選擇使用對(duì)少個(gè)主成分進(jìn)行計(jì)算。每個(gè)主成分實(shí)際上代表的是相關(guān)基因集的信息,因此確定多少個(gè)主成分是一個(gè)重要的步驟,我們可以根據(jù)PCElbowPlot函數(shù)來判斷。

      從上圖可以看到,拐點(diǎn)出現(xiàn)在10-15之間,我們可以選擇15來進(jìn)行聚類分析。Seurat采用的是基于圖形的聚類方法,即利用PCA空間中的歐幾里德距離構(gòu)造一個(gè)KNN圖(數(shù)學(xué)好的可以留下來幫忙講講)。

      好了,到此我們就知道了我們的數(shù)據(jù)中有多少種細(xì)胞亞群了,怎么可以少得了圖片展示呢。超棒的可視化方法tSNE要上場(chǎng)了。tSNE的目標(biāo)是將在高維空間中具有相似局部鄰域的細(xì)胞,在低維空間中放在一起。

      既然我們知道了有多少種細(xì)胞亞群,那么是不是就要分析一下這些亞群間的差異性呢,交給FindAllMarkers吧。FindAllMarkers能夠同時(shí)計(jì)算所有亞群的差異性(分別計(jì)算每個(gè)亞群與剩下的所有細(xì)胞的差異性)。

      得到差異表達(dá)基因后,當(dāng)然要進(jìn)行展示了。

      好了,剩下的就是進(jìn)行生物學(xué)知識(shí)挖掘了,例如根據(jù)這些差異基因推斷細(xì)胞類型啊之類的。
      關(guān)于單個(gè)樣本的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析就介紹到這兒了,那多個(gè)樣本的分析會(huì)有什么不同呢,我們下次再說吧。

      Manta:一款方便臨床測(cè)序使用的快速檢測(cè)結(jié)構(gòu)變異和INDEL 的軟件

      摘要: Manta軟件可以從比對(duì)文件中檢測(cè)SVs和indels。它主要開發(fā)用于檢測(cè)單個(gè)樣品的germline變異和tumor/normal配對(duì)樣品的somatic變異。它可以在一套流程中高效的發(fā)現(xiàn)、組裝、打分大范圍的SVs,中型indels和大型insertions。該軟件主要用于標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算硬件上進(jìn)行快速的分析:NA12878細(xì)胞系50x覆蓋基因組可以在20核服務(wù)器上20分鐘分析完畢,大多數(shù)WGS tumor/normal配對(duì)樣品可以在2個(gè)小時(shí)內(nèi)分析完畢。在SV的檢測(cè)和打分過程中,Manta結(jié)合paired-read和split-read來提高準(zhǔn)確性,但是在有其他有力證據(jù)的情況下,不需要利用split-read或者斷點(diǎn)組裝來報(bào)告融合。Manta通過連續(xù)組裝的方法可以使分辨率達(dá)到堿基級(jí)別,更有利于下游的注釋和臨床意義分析。Manta軟件接受輸入BAM或CRAM格式文件,并以VCF4.1的格式報(bào)告所有的SV和indels突變。

      引言: 目前許多前進(jìn)的結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)方法都集中在科學(xué)研究和群體基因組上。然而,目前還沒有一個(gè)流程專注于快速檢測(cè)單個(gè)或者成組樣本的多種類型變異。Manta軟件主要專注于臨床領(lǐng)域,可以根據(jù)輸入的比對(duì)文件和基因組文件,迅速對(duì)變異進(jìn)行發(fā)現(xiàn)、組裝、打分。它可以對(duì)二倍體的germline類型變異,tumor/normal配對(duì)的somatic變異進(jìn)行檢測(cè),而RNA-Seq分析,de novo變異分析,不配對(duì)的tumor樣品變異分析應(yīng)用還在開發(fā)中。在與其他代表型的工具的比較中,Manta軟件可以在顯著降低計(jì)算成本的情況下,高質(zhì)量的檢測(cè)變異。

      方法:

      流程匯總 : Manta流程設(shè)計(jì)用于高并行的檢測(cè)單個(gè)或成組的樣品。它運(yùn)行包括兩個(gè)階段:1、首先建立基因組內(nèi)所有斷裂關(guān)聯(lián)圖表,2、對(duì)圖表中的組成部分進(jìn)行處理,包括備選假設(shè)變異的生成、組裝、打分以及VCF文件的報(bào)出。斷點(diǎn)關(guān)聯(lián)圖表包括了任意基因組區(qū)域內(nèi)遠(yuǎn)距離相關(guān)的邊界,和indel組裝區(qū)域的自邊界。由于這個(gè)圖表不含具體的假設(shè)變異,所以它非常的緊湊,可以在基因組范圍內(nèi)進(jìn)行大片段的重構(gòu)。在圖表重構(gòu)后,單獨(dú)的邊界(應(yīng)該是相關(guān)的變異)用于后續(xù)變異的分析。每個(gè)邊界都被分析,用于尋找不精確的假設(shè)變異,每個(gè)變異reads都會(huì)被組裝并重新比對(duì)到基因組上。每個(gè)變異都會(huì)嘗試進(jìn)行組裝,但是組裝不是報(bào)告一個(gè)變異的必須步驟。在先前的germline和somatic變異模型下,所有paired-read和split-read的證據(jù)會(huì)被整合成一個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù),相應(yīng)的過濾指標(biāo)也會(huì)補(bǔ)充這個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù),以提高變異變異檢測(cè)的精度。為了便于應(yīng)用,Manta會(huì)自動(dòng)評(píng)估插入片段的大小分布排除基因組中高重復(fù)區(qū)域。

      變異檢測(cè)評(píng)估: 在CEPH 譜系 1463上評(píng)估了變異軟件的germline檢出能力。為了獲得一致的變異檢出結(jié)果并提供軟件之間的recall比較,選擇了公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)的軟件進(jìn)行變異檢測(cè)并比較。選擇Pindel用于檢測(cè)indels,選擇Delly用于檢測(cè)SVs。每種檢測(cè)軟件檢出的變異與Manta檢測(cè)出的變異會(huì)建立pedigree變異一致數(shù)據(jù)集,用于軟件的精度的比較,選擇的數(shù)據(jù)集是NA12878細(xì)胞系。Delly軟件也被當(dāng)做是檢測(cè)somtaitc變異的基準(zhǔn)軟件,比較了它與Manta在乳腺癌細(xì)胞系HCC1954上的檢出能力。

      ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?Recall =? ?召回率,評(píng)估的是靈敏度

      ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?Precision =? ?精確率,評(píng)估的是特異性
      結(jié)果: 表1 結(jié)果 從NA12878細(xì)胞系的SVs(大片段的缺失和重復(fù))檢測(cè)結(jié)果來看,Manta具有較高的召回率。從NA12878細(xì)胞系的Indels檢測(cè)結(jié)果來看,相對(duì)于500bp一下的小的插入缺失,大的插入缺失Manta軟件的召回率優(yōu)勢(shì)更為明顯。從HCC1954觀測(cè)到Manta軟件在所有變異類型中都具有強(qiáng)大的性能,并且所有類型中組裝到basepair分辨率的比例都很高。

      表2結(jié)果:通過運(yùn)行時(shí)間或者內(nèi)存度量,Manta軟件在提供更多種類變異類型檢測(cè)時(shí),具有更低的計(jì)算消耗和計(jì)算時(shí)間。
      Manta軟件詳細(xì)的變異檢測(cè)算法原理稍后補(bǔ)充

      參考文獻(xiàn):

      Xiaoyu C , Ole S T , Richard S , et al. Manta: rapid detection of structural variants and indels for germline and cancer sequencing applications[J]. Bioinformatics, 2016(8):1220-1222. 關(guān)于測(cè)序數(shù)據(jù)分析軟件和測(cè)序數(shù)據(jù)處理的介紹到此就結(jié)束了,不知道你從中找到你需要的信息了嗎 ?如果你還想了解更多這方面的信息,記得收藏關(guān)注本站。 測(cè)序數(shù)據(jù)分析軟件的介紹就聊到這里吧,感謝你花時(shí)間閱讀本站內(nèi)容,更多關(guān)于測(cè)序數(shù)據(jù)處理、測(cè)序數(shù)據(jù)分析軟件的信息別忘了在本站進(jìn)行查找喔。

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